Biofarmaka: Komplexní průvodce výrobou proteinových léčiv

Biofarmaka, známá také jako biologická léčiva, představují rychle rostoucí segment farmaceutického průmyslu. Na rozdíl od tradičních malomolekulárních léků syntetizovaných chemicky jsou biofarmaka velké, komplexní molekuly produkované pomocí živých buněk nebo organismů. Proteinová léčiva, významná podskupina biofarmak, nabízejí cílené terapie pro širokou škálu onemocnění, včetně rakoviny, autoimunitních poruch a infekčních chorob. Tento průvodce poskytuje komplexní přehled výroby proteinových léčiv, pokrývající klíčové aspekty od vývoje buněčných linií až po finální formulaci produktu a kontrolu kvality.

Co jsou proteinová léčiva?

Proteinová léčiva jsou terapeutické proteiny určené k léčbě nebo prevenci onemocnění. Zahrnují rozmanitou škálu molekul, jako jsou:

• Monoklonální protilátky (mAbs): Vysoce specifické protilátky, které cílí na specifické antigeny, často používané v imunoterapii rakoviny a léčbě autoimunitních onemocnění. Příklady zahrnují adalimumab (Humira®) a trastuzumab (Herceptin®).
• Rekombinantní proteiny: Proteiny produkované pomocí technologie rekombinantní DNA, která umožňuje velkovýrobu terapeutických proteinů. Inzulin (Humulin®) je klasickým příkladem.
• Enzymy: Proteiny, které katalyzují biochemické reakce, používané k léčbě enzymových deficitů nebo jiných metabolických poruch. Příklady zahrnují imiglucerázu (Cerezyme®) pro Gaucherovu chorobu.
• Fúzní proteiny: Proteiny vytvořené spojením dvou nebo více proteinů, často používané ke zvýšení terapeutické účinnosti nebo k cílení na specifické buňky. Etanercept (Enbrel®) je fúzní protein používaný k léčbě revmatoidní artritidy.
• Cytokiny a růstové faktory: Proteiny, které regulují růst a diferenciaci buněk, používané ke stimulaci imunitního systému nebo podpoře opravy tkání. Interferon alfa (Roferon-A®) a erytropoetin (Epogen®) jsou příklady.

Proces výroby proteinových léčiv: Přehled

Výroba proteinových léčiv je komplexní, vícestupňový proces, který vyžaduje přísné kontroly a pečlivé provedení. Obecný pracovní postup lze rozdělit do následujících fází:

1. Vývoj buněčné linie: Výběr a inženýrství buněk pro efektivní produkci požadovaného proteinu.
2. Upstream procesy: Kultivace buněk v bioreaktorech pro maximalizaci exprese proteinu.
3. Downstream procesy: Izolace a purifikace proteinu z buněčné kultury.
4. Formulace a plnění: Příprava finálního lékového produktu ve vhodné formulaci pro podání.
5. Kontrola kvality a analytika: Zajištění bezpečnosti, účinnosti a konzistence lékového produktu.

1. Vývoj buněčné linie: Základ produkce proteinů

Buněčná linie použitá pro produkci proteinů je klíčovým faktorem určujícím kvalitu a výtěžek finálního produktu. Savčí buněčné linie, jako jsou buňky vaječníku čínského křečka (CHO), jsou široce používány díky své schopnosti provádět komplexní posttranslační modifikace (např. glykosylaci), které jsou často nezbytné pro funkci proteinu a imunogenicitu. V závislosti na specifickém proteinu a jeho požadavcích se používají i jiné buněčné linie, včetně lidských embryonálních ledvinových (HEK) 293 buněk a hmyzích buněk (např. Sf9).

Klíčové aspekty při vývoji buněčné linie:

• Úrovně exprese proteinu: Výběr buněk, které produkují vysoké množství cílového proteinu, je klíčový pro efektivní výrobu. To často zahrnuje genové inženýrství pro optimalizaci genové exprese.
• Kvalita proteinu: Buněčná linie by měla produkovat protein se správným skládáním, glykosylací a dalšími posttranslačními modifikacemi, aby byla zajištěna správná funkce a minimalizována imunogenicita.
• Stabilita buněk: Buněčná linie by měla být geneticky stabilní, aby zajistila konzistentní produkci proteinu po několik generací.
• Škálovatelnost: Buněčná linie by měla být vhodná pro velkoobjemovou kultivaci v bioreaktorech.
• Soulad s předpisy: Buněčná linie musí splňovat regulační požadavky na bezpečnost a kvalitu.

Příklad: Vývoj buněčné linie CHO

CHO buňky jsou běžně upravovány pro expresi rekombinantních proteinů pomocí různých technik, včetně:

• Transfekce: Vnesení genu kódujícího cílový protein do CHO buněk.
• Selekce: Výběr buněk, které úspěšně integrovaly gen a exprimují protein. Často se používají selekční markery (např. geny rezistence k antibiotikům).
• Klonování: Izolace jednotlivých buněk a jejich pěstování do klonálních buněčných linií. Tím se zajistí, že všechny buňky v populaci jsou geneticky identické.
• Optimalizace: Optimalizace podmínek buněčné kultury (např. složení média, teplota, pH) pro maximalizaci exprese a kvality proteinu.

2. Upstream procesy: Kultivace buněk pro produkci proteinů

Upstream procesy zahrnují kultivaci vybrané buněčné linie v bioreaktorech za účelem produkce cílového proteinu. Bioreaktor poskytuje kontrolované prostředí s optimálními podmínkami pro růst buněk a expresi proteinů. Klíčové parametry, které je třeba pečlivě kontrolovat, zahrnují teplotu, pH, rozpuštěný kyslík a přísun živin.

Typy bioreaktorů:

• Dávkové bioreaktory: Uzavřený systém, kde jsou všechny živiny přidány na začátku kultivace. Jedná se o jednoduchou a levnou metodu, ale produkce proteinů je omezena vyčerpáním živin a hromaděním odpadních produktů.
• Fed-batch bioreaktory: Živiny jsou přidávány periodicky během kultivace, aby se udržel optimální růst buněk a exprese proteinů. To umožňuje vyšší hustotu buněk a výtěžky proteinů ve srovnání s dávkovými kulturami.
• Kontinuální bioreaktory (Perfuzní): Živiny jsou kontinuálně přidávány a odpadní produkty jsou kontinuálně odstraňovány. To poskytuje stabilní prostředí pro růst buněk a expresi proteinů, což vede k ještě vyšší hustotě buněk a výtěžkům proteinů. Perfuzní systémy se často používají pro velkovýrobu.

Optimalizace média:

Kultivační médium poskytuje živiny a růstové faktory nezbytné pro růst buněk a produkci proteinů. Optimální složení média závisí na buněčné linii a cílovém proteinu. Optimalizace média zahrnuje úpravu koncentrací různých složek, jako jsou:

• Aminokyseliny: Stavební kameny proteinů.
• Vitamíny: Nezbytné pro buněčný metabolismus.
• Růstové faktory: Stimulují růst a diferenciaci buněk.
• Soli a minerály: Udržují osmotickou rovnováhu a poskytují nezbytné ionty.
• Cukry: Poskytují energii pro buněčný metabolismus.

Monitorování a řízení procesu:

Během upstream procesů je nezbytné monitorovat a řídit klíčové procesní parametry, aby byl zajištěn optimální růst buněk a exprese proteinů. To zahrnuje použití senzorů k měření parametrů, jako je teplota, pH, rozpuštěný kyslík, hustota buněk a koncentrace proteinů. Řídicí systémy se používají k automatické úpravě těchto parametrů, aby se udržely v požadovaném rozmezí.

3. Downstream procesy: Izolace a purifikace proteinu

Downstream procesy zahrnují izolaci a purifikaci cílového proteinu z buněčné kultury. Jedná se o kritický krok v procesu výroby proteinových léčiv, protože odstraňuje nečistoty, které by mohly ovlivnit bezpečnost a účinnost finálního produktu. Downstream procesy obvykle zahrnují řadu kroků, včetně:

Rozrušení buněk:

Pokud se protein nachází uvnitř buněk, musí být buňky rozrušeny, aby se protein uvolnil. Toho lze dosáhnout různými metodami, jako jsou:

• Mechanické rozrušení: Použití vysokotlaké homogenizace nebo sonikace k rozbití buněk.
• Chemické rozrušení: Použití detergentů nebo organických rozpouštědel k solubilizaci buněčných membrán.
• Enzymatické rozrušení: Použití enzymů k degradaci buněčných stěn.

Čiření:

Po rozrušení buněk musí být buněčné zbytky odstraněny, aby se proteinový roztok vyčistil. Toho se obvykle dosahuje pomocí centrifugace nebo filtrace.

Purifikace proteinu:

Protein se poté purifikuje pomocí různých chromatografických technik, jako jsou:

• Afinitní chromatografie: Využívá ligand, který se specificky váže na cílový protein. Jedná se o vysoce selektivní techniku, která může dosáhnout vysoké čistoty v jediném kroku. Například protilátky nebo proteiny s tagy (např. His-tag proteiny) se často purifikují pomocí afinitní chromatografie.
• Iontoměničová chromatografie: Separuje proteiny na základě jejich náboje. Katexová chromatografie se používá k vazbě kladně nabitých proteinů, zatímco anexová chromatografie se používá k vazbě záporně nabitých proteinů.
• Velikostně-vylučovací chromatografie: Separuje proteiny na základě jejich velikosti. Větší proteiny eluují dříve, zatímco menší proteiny eluují později.
• Hydrofobní interakční chromatografie: Separuje proteiny na základě jejich hydrofobicity. Hydrofobní proteiny se vážou na kolonu při vysokých koncentracích solí a jsou eluovány se snižující se koncentrací solí.

Ultrafiltrace/Diafiltrace:

Ultrafiltrace a diafiltrace se používají ke koncentraci proteinového roztoku a odstranění solí a dalších malých molekul. Ultrafiltrace používá membránu k separaci molekul na základě jejich velikosti, zatímco diafiltrace používá membránu k odstranění malých molekul přidáním pufru. Tento krok je klíčový pro přípravu proteinu pro formulaci.

Virová clearance:

Virová clearance je kritickým bezpečnostním hlediskem u biofarmak. Downstream procesy musí zahrnovat kroky k odstranění nebo inaktivaci jakýchkoli virů, které mohou být přítomny v buněčné kultuře. Toho lze dosáhnout pomocí filtrace, chromatografie nebo tepelné inaktivace.

4. Formulace a plnění: Příprava finálního lékového produktu

Formulace zahrnuje přípravu purifikovaného proteinu ve stabilní a vhodné formě pro podání pacientům. Formulace musí chránit protein před degradací, udržovat jeho aktivitu a zajistit jeho bezpečnost.

Klíčové aspekty při vývoji formulace:

• Stabilita proteinu: Proteiny jsou náchylné k degradaci různými faktory, jako je teplota, pH, oxidace a agregace. Formulace musí protein před těmito faktory chránit.
• Rozpustnost: Protein musí být ve formulaci rozpustný, aby umožnil snadné podání.
• Viskozita: Viskozita formulace musí být dostatečně nízká, aby umožnila snadnou injekci.
• Tonicita: Tonicita formulace musí být kompatibilní s tělními tekutinami, aby se předešlo bolesti nebo podráždění při injekci.
• Sterilita: Formulace musí být sterilní, aby se předešlo infekci.

Běžné pomocné látky používané v proteinových formulacích:

• Pufry: Udržují pH formulace. Příklady zahrnují fosfátové pufry, citrátové pufry a Tris pufry.
• Stabilizátory: Chrání protein před degradací. Příklady zahrnují cukry (např. sacharóza, trehalóza), aminokyseliny (např. glycin, arginin) a surfaktanty (např. polysorbát 80, polysorbát 20).
• Modifikátory tonicity: Upravují tonicitu formulace. Příklady zahrnují chlorid sodný a mannitol.
• Konzervanty: Zabraňují mikrobiálnímu růstu. Příklady zahrnují benzylalkohol a fenol. (Poznámka: Konzervantům se často vyhýbá u jednodávkových formulací).

Plnění:

Plnění zahrnuje aseptické plnění formulovaného proteinového léčiva do lahviček nebo stříkaček. Jedná se o kritický krok, který musí být prováděn za přísných sterilních podmínek, aby se zabránilo kontaminaci. Naplněné lahvičky nebo stříkačky jsou poté označeny, zabaleny a skladovány za vhodných podmínek.

5. Kontrola kvality a analytika: Zajištění bezpečnosti a účinnosti produktu

Kontrola kvality (QC) je nezbytnou součástí výroby proteinových léčiv. Zahrnuje řadu testů a zkoušek, které zajišťují, že lékový produkt splňuje předem definované specifikace pro bezpečnost, účinnost a konzistenci. QC testování se provádí v různých fázích výrobního procesu, od vývoje buněčné linie až po uvolnění finálního produktu.

Klíčové testy kontroly kvality:

• Testování identity: Potvrzuje, že lékový produkt je správný protein. Toho lze dosáhnout různými metodami, jako je peptidové mapování a hmotnostní spektrometrie.
• Testování čistoty: Určuje množství nečistot v lékovém produktu. Toho lze dosáhnout různými chromatografickými technikami, jako je HPLC a SDS-PAGE.
• Testování účinnosti (potency): Měří biologickou aktivitu lékového produktu. Toho lze dosáhnout pomocí buněčných testů nebo vazebných testů.
• Testování sterility: Potvrzuje, že lékový produkt neobsahuje mikrobiální kontaminaci.
• Testování endotoxinů: Měří množství endotoxinů v lékovém produktu. Endotoxiny jsou bakteriální toxiny, které mohou způsobit horečku a zánět.
• Testování pyrogenů: Zjišťuje přítomnost pyrogenů, látek, které mohou způsobit horečku.
• Testování stability: Hodnotí stabilitu lékového produktu v čase za různých skladovacích podmínek.

Analytické techniky používané v QC biofarmak:

• Vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC): Používá se k oddělení a kvantifikaci různých složek ve směsi.
• Hmotnostní spektrometrie (MS): Používá se k identifikaci a kvantifikaci proteinů a dalších molekul.
• Elektroforéza (SDS-PAGE, kapilární elektroforéza): Používá se k separaci proteinů na základě jejich velikosti a náboje.
• Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA): Používá se k detekci a kvantifikaci specifických proteinů.
• Buněčné testy: Používají se k měření biologické aktivity proteinů.
• Biolayer Interferometry (BLI): Používá se k měření interakcí mezi proteiny.
• Povrchová plazmonová rezonance (SPR): Používá se také k měření interakcí mezi proteiny a vazebné kinetiky.

Regulační aspekty

Výroba biofarmak je vysoce regulována regulačními agenturami po celém světě, jako je americký Úřad pro kontrolu potravin a léčiv (FDA), Evropská agentura pro léčivé přípravky (EMA) a Světová zdravotnická organizace (WHO). Tyto agentury stanovují standardy pro výrobní procesy, kontrolu kvality a klinické studie, aby byla zajištěna bezpečnost a účinnost biofarmaceutických produktů. Klíčové regulační pokyny zahrnují Správnou výrobní praxi (SVP), která stanoví požadavky na výrobní zařízení, vybavení a personál.

Biosimilars: Rostoucí trh

Biosimilars jsou biofarmaceutické produkty, které jsou vysoce podobné již schválenému referenčnímu produktu. Nejsou to přesné kopie referenčního produktu kvůli inherentní složitosti biologických molekul a výrobních procesů. Biosimilars však musí prokázat, že jsou vysoce podobné referenčnímu produktu z hlediska bezpečnosti, účinnosti a kvality. Vývoj a schvalování biosimilars nabízí potenciál snížit náklady na zdravotní péči a zvýšit přístup pacientů k důležitým lékům. Země po celém světě mají různé regulační cesty pro schvalování biosimilars, ale základním principem je zajistit srovnatelnost s originálním biologickým léčivem.

Budoucí trendy ve výrobě proteinových léčiv

Oblast výroby proteinových léčiv se neustále vyvíjí, objevují se nové technologie a přístupy ke zlepšení účinnosti, snížení nákladů a zvýšení kvality produktů. Některé z klíčových trendů, které formují budoucnost výroby proteinových léčiv, zahrnují:

• Kontinuální výroba: Přechod od dávkového zpracování ke kontinuální výrobě, která nabízí zvýšenou efektivitu, snížené náklady a zlepšenou kvalitu produktu.
• Procesní analytická technologie (PAT): Použití monitorování a řízení procesů v reálném čase k optimalizaci výrobních procesů a zajištění konzistentní kvality produktu.
• Technologie na jedno použití: Použití jednorázového vybavení ke snížení rizika kontaminace a eliminaci potřeby čištění a sterilizace.
• Vysokokapacitní screening: Použití automatizovaných systémů ke screeningu velkého počtu buněčných linií a procesních podmínek k identifikaci optimálních podmínek pro produkci proteinů.
• Pokročilá analytika: Vývoj sofistikovanějších analytických technik pro charakterizaci komplexní struktury a funkce proteinových léčiv.
• Personalizovaná medicína: Přizpůsobení terapií proteinovými léčivy jednotlivým pacientům na základě jejich genetické výbavy a dalších faktorů. To zahrnuje vývoj doprovodné diagnostiky k identifikaci pacientů, kteří s největší pravděpodobností budou mít z dané terapie prospěch.
• AI a strojové učení: Využití umělé inteligence a strojového učení k optimalizaci návrhu, výroby a formulace proteinových léčiv. To zahrnuje předpovídání struktury a funkce proteinů, optimalizaci podmínek buněčné kultury a vývoj stabilnějších a účinnějších formulací.

Závěr

Výroba proteinových léčiv je komplexní a náročný proces, který vyžaduje multidisciplinární přístup. Od vývoje buněčné linie až po konečnou formulaci produktu a kontrolu kvality musí být každý krok pečlivě kontrolován, aby byla zajištěna bezpečnost, účinnost a konzistence lékového produktu. Jak technologie pokračuje v pokroku, je oblast výroby proteinových léčiv připravena na další inovace, které povedou k vývoji nových a vylepšených terapií pro širokou škálu nemocí. Rostoucí globální poptávka po biofarmakách vyžaduje neustálé zlepšování výrobních procesů, aby bylo možné uspokojit potřeby pacientů po celém světě. Vývoj biosimilars také poskytuje příležitosti k rozšíření přístupu k těmto život zachraňujícím lékům.